Какова вероятность ошибки положительного теста на коронавирус

Существует ли различие между частотой ложноотрицательных результатов теста у асимптомных пациентов (более низкая вирусная нагрузка) по сравнению с симптомными пациентами (более высокая вирусная нагрузка)?

Вероятнее всего большее число ложноотрицательных результатов отмечается у асимптомных пациентов с коронавирусной инфекцией. Однако на данный момент не было выполнено крупных исследований, оценивших различия между группами (в том числе, необходимо проанализировать сероконверсию и провести тесты ПЦР). 

• Следует отметить, что бессимптомные пациенты могут выделять вирус в высоких титрах В настоящее время серологические лонгитюдные исследования находятся в процессе.

Исследования, выполненные в домах престарелых и круизных лайнерах показали, что значительное количество пациентов имели вирус, культивируемый за 6 дней до появления симптомов.

Позволяют ли доступные в настоящее время тесты различать SARS-CoV-2 и другие коронавирусы, которые могут быть похожими? Как это повлияет на точность и надежность теста?

• Доступные мультипанели тестов ПЦР на респираторные вирусы не определяют SARS-CoV-2. В настоящее время многие компании работают над тем, чтобы включить тест на новый коронавирус в уже имеющиеся панели тестов. 
• Тест на ПЦР SARS-CoV-2 не позволяет определить наличие других коронавирусов (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63 и HCoV-HKU1) или MERS-CoV.
• Нельзя сравнивать доступные в настоящее время тесты на коронавирус ввиду их различной чувствительности и специфичности. Более того, даже если тест имеет специфичность от 96% до 98%, если вероятность претеста  COVID-19 составляет <5%, более вероятно, что результат будет ложноположительным, чем истинно положительным — и это одна из ключевых причин почему массовое серологическое тестирование не рекомендуется.
• Причинами ложноположительных результатов являются перекрестная реактивность с другими коронавирусами, образование антител из-за других механизмов или низкая точность теста.

Источник: Eugenia Yun. COVID Testing FAQ, From Reinfection to Persistent Positives. Medscape. June 10, 2020.

МОСКВА, 6 дек — РИА Новости, Татьяна Пичугина. Недавняя публикация ученых из Сеченовского университета о том, что почти половина анализов на возбудителя COVID-19 не дают реальной картины, вызвала множество вопросов. Насколько точны ПЦР-тесты и нужны ли они для диагноза? РИА Новости разбирается в ПЦР-диагностике и почему в нее закрадываются ошибки.

Как выявляют вирус в организме

«Тяжело заболел наш сотрудник. Поднялась высокая температура, положили в больницу. Все признаки COVID-19, — рассказывает Алексей Чемерис, доктор биологических наук, профессор, сотрудник Института биохимии и генетики Уфимского ФИЦ РАН. — А ПЦР-анализ, который ему сделали в специальном медицинском центре наши коллеги-профессионалы, как только он почувствовал недомогание, — отрицательный. Видимо, в тот момент у больного было мало вирусных частиц в организме — за пределами чувствительности теста».

Ученые называют такие результаты ложнонегативными — инфекция проявляется внешне, а тест на возбудителя — «чистый». Тут дело и в самом методе, и в его массовом применении.

Когда медсестра берет мазок из ротоглотки и носоглотки, на кончике зонда остается немного влаги, а в ней — клетки эпителия. Зонд опускают в пластиковую пробирку с раствором (эппендорф) и кончик отламывают, чтобы закрыть емкость. В лаборатории ее помещают в центрифугу, проводят ряд манипуляций для выделения из клеток фрагментов вирусного генома. В случае с COVID-19 — это РНК коронавируса SARS-CoV-2.

В образовавшийся раствор добавляют праймеры — искусственные участки генома коронавируса, именно они опознают SARS-CoV-2, и один из них служит затравкой для синтеза цепочки ДНК под действием определенного фермента на основе механизма обратной транскрипции. Фактически получается ДНК-копия участка коронавируса, которую уже можно размножать. Для этого запускают ПЦР — полимеразную цепную реакцию. За несколько десятков циклов она увеличивает число копий ДНК, а специальный флуоресцентный краситель подсвечивает их в пробирке, сигнализируя о вирусе. Если в биоматериале нет вирусных частиц, ампликонов (продуктов ПЦР) не будет вовсе, результат — отрицательный. Если вируса очень мало, итоговое количество ампликонов по завершении ПЦР окажется за пределами чувствительности прибора и результат — ложноотрицательным.

Тонкости метода

В ПЦР-диагностике много нюансов, объясняет Алексей Чемерис. В лаборатории для научных целей выявляют даже единичные копии вирусного генома в образце, при массовом применении чувствительность обычно на порядки ниже.

«Из-за случайных мутаций генома праймеры могут не сработать, если однонуклеотидные замены или даже более значительные изменения генома вируса пришлись как раз на эти участки. Вероятность невысока, но она есть», — отмечает ученый.

Возможны сбои при ручных операциях, которых не так много. Одна из них — извлечение вирусной РНК из образца. Автоматический экстрактор нуклеиновых кислот стоит довольно дорого, поэтому обычно эту процедуру доверяют лаборанту. Редко, но ложноположительные результаты случаются, в том числе из-за особенностей ПЦР или загрязнения образца.

Чаще всего, однако, проблемы возникают до того, как пробирка попала в лабораторию. Вот что пишут авторы статьи в журнале «Вестник Росздравнадзора»: «В настоящее время имеются неопровержимые доказательства того, что преаналитическая фаза является основным источником ошибок в лабораторных исследованиях, когда они используются для диагностических или исследовательских целей». Они публикуют целый список нарушений, ведущих к ложноотрицательным результатам.

Ключевой этап — подготовка к исследованию. «За три часа до анализа нельзя есть, пить, курить и полоскать рот. Дело в том, что коронавирус поражает клетки слизистой оболочки дыхательных путей. Проникая в них, он начинает размножаться, накапливается на их поверхности. Но есть еще и эпителиальные клетки, которые часто обновляются. Вместе с водой, едой и избытком слюны при курении и жевании жвачки эпителиальные клетки попадают в пищевод. В результате вероятность обнаружить вирус в мазке падает практически до нуля», — комментирует Тамара Силкина, врач клинической лабораторной диагностики, директор по лабораторным технологиям «Гемотеста».

Не менее важна процедура взятия биоматериала. Если неверно выбрать точку для мазка, например, из-за кашля или рвотного рефлекса, на зонд может не попасть достаточное количество клеток. На результат также влияют нарушения технологии хранения, транспортировки образцов.

«Цена ошибки очень высока — процент выявляемости коронавирусной инфекции снизится, а скорость ее распространения вырастет. Люди, получившие ложноотрицательные результаты, будут чувствовать себя спокойно, выходить в общественные места и контактировать с окружающими», — уточняет представитель «Гемотеста».

Ключевой этап — подготовка к исследованию. «За три часа до анализа нельзя есть, пить, курить и полоскать рот. Дело в том, что коронавирус поражает клетки слизистой оболочки дыхательных путей. Проникая в них, он начинает размножаться, накапливается на их поверхности. Но есть еще и эпителиальные клетки, которые часто обновляются. Вместе с водой, едой и избытком слюны при курении и жевании жвачки эпителиальные клетки попадают в пищевод. В результате вероятность обнаружить вирус в мазке падает практически до нуля», — комментирует Тамара Силкина, врач клинической лабораторной диагностики, директор по лабораторным технологиям «Гемотеста».

Не менее важна процедура взятия биоматериала. Если неверно выбрать точку для мазка, например, из-за кашля или рвотного рефлекса, на зонд может не попасть достаточное количество клеток. На результат также влияют нарушения технологии хранения, транспортировки образцов.

«Цена ошибки очень высока — процент выявляемости коронавирусной инфекции снизится, а скорость ее распространения вырастет. Люди, получившие ложноотрицательные результаты, будут чувствовать себя спокойно, выходить в общественные места и контактировать с окружающими», — уточняет представитель «Гемотеста».

О точности диагностики

В России одобрены к использованию десятки тест-систем для выявления коронавируса. Ключевые характеристики — диагностические специфичность (точность) и чувствительность. Первый параметр показывает способность набора определить конкретный вирус. Второй — возможность обнаружить его части, даже если в биоматериале их очень мало. «Чем эти параметры ближе к ста процентам, тем лучше», — подчеркивает Тамара Силкина.

«Порог чувствительности — общий как для российских, так и для зарубежных тестов: 10³ на миллилитр. То есть должно быть не менее тысячи вирусных геном-эквивалентов на миллилитр образца. «ДНК-технология» заявила о чувствительности 10¹ — десять вирусных единиц на миллилитр. Другой важный показатель — воспроизводимость, то есть возможность получить одинаковый результат в разных условиях. Нужно учитывать и сходимость — отсутствие существенных различий между измерениями, выполненными в одинаковых условиях», — добавляет медик.

Метод ПЦР с обратной транскрипцией хорошо отработан и практически полностью автоматизирован. С момента попадания в лабораторию анализ занимает четыре-шесть часов. В мире эти тесты буквально поставили на поток. Только в Москве, по официальным данным, сделали 12 миллионов анализов.

Поскольку этот метод прямо выявляет возбудителя в организме, его относят к доказательной медицине и рекомендуют учитывать в клинической практике. Однако анализ больших данных говорит, что при массовом использовании ПЦР-тесты часто промахиваются.

Ложнонегативные результаты получаются в 20-66 процентах случаев. Такие данные из литературы приводят исследователи из Сеченовского университета. Вместе с зарубежными коллегами они изучили записи пациентов, госпитализированных в университетскую клинику в апреле — мае. Из 3480 человек, чьи ПЦР-тесты были доступны, примерно половина оказались чистыми. В то же время клиническая картина и КТ легких указывали на коронавирусную инфекцию. Авторы допускают, что в реальной клинической практике ПЦР-анализ не столь и критичен.

«Этиологическая диагностика, которая выявляет причину заболевания, нужна априори, — не соглашается Айрат Мавзютов, заведующий кафедрой фундаментальной и прикладной микробиологии, профессор кафедры лабораторной диагностики Башкирского государственного медицинского университета, руководитель Исследовательского центра «Лаборатория». — При вирусных инфекциях других, сравнимых по чувствительности и специфичности (точности), методов, кроме ПЦР-тестирования, нет».

Важно понимать, объясняет профессор Мавзютов, что клинический диагноз опирается на субъективные данные — анамнез (опрос) и осмотр пациента. На их основании невозможно установить вирусную природу заболевания и тем более какой именно возбудитель его вызвал. Для этого проводятся лабораторные исследования. Получаемые при этом данные, продолжает ученый, намного объективнее, поскольку большинство современных методов лабораторных исследований автоматизировано. Соответственно, на результаты не повлияют случайные факторы: уровень подготовки специалистов, их настроение, «погода в доме» и так далее.

«Диагноз COVID-19 можно поставить, только когда в материале от больного обнаружили РНК вируса SARS CoV-2 методом ПЦР или же антигены этого вируса иммунохимическими методами. Не выявив следов вируса в организме, нельзя говорить о «ковидной» природе заболевания или летального исхода», — утверждает Айрат Мавзютов.

Он обращает внимание на еще один аспект. ПЦР-тест не отличает РНК вируса, способного к репродукции, то есть размножению, от обломков «нежизнеспособных» вирусных частиц. Он лишь позволяет понять, присутствует или нет РНК коронавируса в клетках.

«Пока инфицированные клетки не заменятся на новые, а на это уходит от двух до четырех недель, не исключены положительные результаты. При этом вирус может быть уже «мертвым», человек здоров и никому не опасен», — отмечает профессор. Для уточнения учитываются данные целого ряда дополнительных исследований, позволяющих на лабораторном уровне оценивать остроту воспалительного процесса или образование антител на стадии его завершения.

Альтернатива ПЦР-диагностике

В любом случае нужно повышать чувствительность тест-систем на основе ПЦР, заключает Алексей Чемерис, а для этого нужны другие подходы. «Надо сделать так, чтобы ложнонегативных результатов было меньше, практически исключить их», — считает он.

В обзоре, подготовленном вместе с коллегами, профессор Чемерис рассматривает преимущества и недостатки ПЦР-диагностики и других методов амплификации — копировании РНК бетакоронавирусов, к которым относится SARS-CoV-2. Теоретически весьма перспективен метод петлевой амплификации — LAMP, где используют сразу шесть или восемь праймеров.

«С одной стороны, повышается специфичность: только когда все праймеры отожгутся (сработают, распознав РНК коронавируса. — Прим. ред.), начнется амплификация, с другой — вирус мутирует и шансы, что реакция не пойдет, увеличиваются, поскольку какие бы участки генома ни выбрать, все равно вероятность мутаций больше в восьми участках, чем в двух или трех (при использовании гибридизационного зонда), достаточных для ПЦР», — объясняет исследователь.

Во время предшествующей эпидемии SARS возбудителя выявляли с помощью реакции NASBA (амплификации на основе секвенирования нуклеиновых кислот) и RCA (репликации по типу катящегося кольца). Геномный редактор CRISPR-Cas также пробуют применять для идентификации РНК нового коронавируса. Есть работы по полногеномному секвенированию любого генетического материала, находящегося в биоматериале. Метод очень чувствительный, но дорогой и долгий — занимает 20 часов. Так что в ближайшее время ПЦР с обратной транскрипцией останется самым массовым способом обнаружения коронавируса в организме.

– Денис Владимирович, сориентируйте, пожалуйста, наших читателей в многообразии имеющихся диагностических тестов.

– Самый распространенный тест — на выявление генома вируса. У некоторых вирусов (ВИЧ, грипп, коронавирус) геном представлен не молекулой ДНК, а рибонуклеиновой кислотой — РНК. Но суть теста от этого не меняется, это обычная ДНК-диагностика. В подавляющем большинстве случаев она основана на методе ПЦР — полимеразной цепной реакции. Это самый надежный метод ДНК-диагностики, золотой стандарт определения вирусных инфекций. В среднем исследование занимает 3-4 часа. Но поскольку надо доставить образец в лабораторию, зарегистрировать его и пр., то времени уходит чуть больше. Как правило лаборатории заявляют, что выполнят тест от 8 часов до 2-3 дней. Если некоторые лаборатории заявляют, что «Результат будет сегодня», а другие обещают это только через 3 дня, это связано не с продолжительностью собственно анализа, а с логистикой обработки биоматериала.

– Кто сегодня производит эти тесты?

– На начало апреля в России уже семь производителей тест-систем для ДНК-диагностики имеют регистрационное удостоверение Росздравнадзора (документ, разрешающий применение теста в клинической лабораторной диагностике). Более-менее все они одинаковы по своей чувствительности и специфичности. Хотя самые первые тесты, рекомендованные к применению в феврале, отличались немного пониженной чувствительностью.

– То есть, в том случае, когда один аналог давал положительный результат, указывая на болезнь, другой мог дать отрицательный?

– Да, разные тест-системы могут давать разный ответ из-за разной заявленной производителем чувствительности реагентов. Кроме того, есть и фактор «врача»: в одном случае у пациента могли взять побольше вируса и его система «увидела», в другом — в пробирку попало меньше вирусных частиц, и ответ был ложно-отрицательным.

– Когда нам говорят: подготовлено столько-то единиц тест-систем, что имеется в виду?

– Один тест — это сочетание реагентов, рассчитанное на проведение анализа одного образца биоматериала (одного пациента). Он включает несколько этапов. Первый этап -высвобождение нуклеиновой кислоты из вируса (занимает минут 30-40), потом идет этап обратной транскрипции — превращение РНК в ДНК и ПЦР-амплификации (1,5 часа).

Каждый набор реагентов, как правило, поставляется в комплекте для анализа 96-ти образцов. Поэтому цифры поставленных тест-систем иногда плавают: кто-то считает комплектами, кто-то единицами тестов. Более корректно считать в единицах.

– Еще совсем недавно вроде бы ощущалась нехватка таких ПЦР-тестов. А сегодня нам сообщают, что Россия поставляет тест-системы в 30 стран мира. У нас действительно хватает тестов на всю страну?

– Семь производителей хорошо справляются с производством. У нас исторически хорошие мощности по производству такого рода реагентов.  

– Почему тогда люди порой подолгу ждут результатов? Моя коллега, у которой подозревали инфицирование SARS-CoV-2, ждала результаты анализа больше недели.

– Дело в том, что ещё недели две назад результаты требовалось подтверждать в Новосибирском центре «Вектор». Если в Москве мы обнаруживали положительный образец, должны были контрольную копию доставить в Новосибирск. Пока анализы доставлялись туда, потом обратно, проходило как раз несколько суток. На сегодня отправка второго образца анализа из клиники идет для повторного подтверждения не в Новосибирск, а в московский региональный центр. На это уходит 1,5-2 дня.

– Такая же система действует и в других областях России?

— Да.

– Когда берут мазок, пациенту сообщают, что за тест, кто его производитель?

— Если это не коммерческое исследование, то скорей, нет. Но смею вас заверить, сегодня все тесты уже относятся к разряду высокочувствительных.

– И все-таки, если человек сдал биоматериал на первый анализ, а он дал отрицательный результат, когда ему назначат повторное взятие пробы?

– Через три дня, когда в биологическом образце частиц вируса будет больше. В течение этих трех дней человек должен быть изолирован. Если оба раза тест будет выдавать отрицательный результат, то в этом случае диагноз COVID-19 не ставится.

– Повторный анализ также производят в двух лабораториях?

– Да, по правилам требуется независимое подтверждение в референсной лаборатории.

— А насколько вероятен вариант с ложно-положительным результатом? После него не назначают повторный анализ?

– Вероятность ложно-положительного ответа при двух повторных тестах в разных лабораториях – менее 0,01%, то есть фактически отсутствует.

– В среду Роспотребнадзор объявил о том, что ряд лабораторий начинают в Москве массовый скрининг всех желающих с помощью платной высокочувствительной тест-системы. То есть, любой житель города может заказать диагностику и ему на дом привезут все необходимое.

– Насколько я понимаю, речь идет о том же, что коммерческие лаборатории практиковали и раньше, — оказывали подобные услуги со сбором биопробы на дому.

– Предлагают даже опцию, которая позволила бы пациенту брать у себя биопробы и отправлять в лабораторию…

– Самодеятельность в этом случае может дать некорректный результат. Брать мазок из горла должен врач или обученный лаборант. Если пациент сам не туда попадет, у него может быть ложно-отрицательный ответ.

– Почему мазок берется из носа и из горла?

– Такой на данный момент алгоритм взятия биоматериала, хотя, по сути, более правильным является мазок из горла.

– По крови можно определить болезнь?

– Для способа ПЦР можно использовать как мазок, так и кровь.

– Сейчас все чаще рекламируют некий экспресс-тест для выявления вирусных частиц в виде тест-полосок. Это альтернатива ПЦР?

– Скорей всего, когда речь идет о тест-полосках, имеется в виду ИФА — иммуно-ферментный анализ. Анализ вирусных частиц можно произвести при помощи ИФА, но вряд ли его сегодня будут использовать. Дело в том, что по точности и чувствительности он сильно уступает вышеописанному способу ПЦР. Зато появляются уже подобные тест-полоски для ИФА-теста на наличие антител в крови человека, уже переболевшего COVID-19. Вот они очень эффективны и дают результат через несколько минут.

Поэтому будьте внимательны и при заказе экспресс-тестов внимательно изучайте их предназначение. Кстати, некоторые производители тест-систем для ПЦР-диагностики могут и ее называть экспресс-тестом, в принципе, 3-4 часа, в течение которых она выполняется, это небольшой срок.

Читайте также: «У бессимптомно болевших коронавирусом обнаружились поражения легких»

Эксперты предупреждают, что ПЦР-тест иногда не выявляет заражение новым штаммом коронавируса «Омикрон», даже при наличии у человека явных признаков заболевания. Причиной могут быть как неправильно взятый анализ, так и несоблюдение пациентом рекомендаций перед проведением тестирования. Рассказываем, каких правил следует придерживаться, чтобы не получить ложный результат.

Неправильный анализ

Врач-инфекционист Евгений Тимаков пояснил, что заражение «Омикроном» может сопровождаться отрицательным ПЦР-тестом. При этом больной все равно остается опасным для окружающих, не подозревая о своем иммунном статусе. По мнению эксперта, при наличии у человека признаков заболевания и отрицательном тесте есть вероятность, что анализ был проведен неправильно.

«Может быть, у него был неправильно взят анализ: или не в тот день, или недостаточное количества материала. «Омикрон»-штамм очень быстро может уходить из носоглотки и не выявляться с помощью тестов», – подчеркнул Тимаков.

Специалист добавил, что тем, у кого не подтвердился коронавирус, но при этом имеется подозрительная симптоматика, следует сократить контакты с людьми. По словам врача, ограничения желательно соблюдать около семи дней, однако продолжительность таких мер варьируется и зависит от тяжести COVID-19.

Вместе с тем эксперт отметил, что заболевший «Омикроном» человек наиболее заразен для окружающих во время инкубационного периода инфекции. Активное вирусовыделение наблюдается у больного в первые два-три дня после инфицирования.

Как избежать ложного результата?

Ложноотрицательный результат тестирования на COVID-19 во многом зависит от подготовки пациента к его сдаче. Об этом Москве 24 рассказал врач – иммунолог-аллерголог Андрей Продеус.

По словам эксперта, взятие мазков рекомендуется проводить не раньше чем через 3–4 часа после последнего приема пищи. «Если вы ели, пили, жевали жвачку, курили, полоскали горло или чистили зубы, то у вас может быть ложноотрицательный ПЦР-тест», – предупреждает он.

Дело в том, что для ПЦР-исследования важно получить мазок с достаточным количеством инфицированных клеток. Еда и вода способны снизить объем вируса на слизистой, в результате чего анализ может показать неправильный диагноз, подчеркнул специалист.

Второй важный пункт – это правильный забор материала. Врач должен брать анализ с задней стенки глотки и с поверхности носовой пазухи, поясняет Андрей Продеус. При качественном взятии мазка можно говорить о корректности полученного результата теста, считает иммунолог.

Однако, по мнению специалиста, ПЦР-тест не является «истиной в последней инстанции».

Вместе с тем эксперт добавил, что при наличии симптомов необходимо сперва обратиться к врачу, а только по его назначению сдавать тест.

«Задача грамотного доктора – назначить те объемы исследований, которые будут эффективны именно для данной ситуации. Для меня ПЦР-тест имеет смысл, если у человека есть клинические признаки проявления болезни. В таком случае я хочу найти патоген, которым он болен», – говорит Андрей Продеус.

Касательно самих ПЦР-тестов, которых к настоящему моменту зарегистрировано несколько десятков, принципиальных различий между ними, по мнению иммунолога, нет.

Экспресс-тест или ПЦР?

Врач – аллерголог-иммунолог Владимир Болибок считает, что сегодня экспресс-тесты вызывают меньше доверия. По его мнению, они довольно часто дают ложноотрицательные результаты.

«В экспресс -тестах используются антитела, направленные против спайк-протеина коронавируса. Как мы знаем, «Омикрон» очень сильно мутировал по сравнению с исходным вирусом, поэтому те антитела, которые используются в некоторых тест-системах, могут пропускать этот спайк-протеин штамма, могут быть к нему не чувствительны», – заявил эксперт в беседе с Москвой 24.

При этом нельзя отменять и другие факторы, способные повлиять на результаты анализа, добавил он.

При наличии симптомов заболевания лучше не ориентироваться на результат теста, полагает Владимир Болибок. По его словам, «сейчас свирепствует пандемия, вероятность, что человек заразился коронавирусом, – 99%».

Альбика Халидова